淺放照射時(shí)間間隔對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原分泌的影響

原題：淺層X射線照射的間隔時(shí)間對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原分泌的影響
作者：鄭文月1,2,馬季2,臧海英2,馮清藍(lán)1,2,王維佳2,米次仁2,鄧成成2,朱定衡2

通信作者：朱定衡,碩士,主治醫(yī)師,E-mail：z127140@sina.com; 鄧成成,博士,副研究員，E-mail：dengchch@smu.edu.cn

作者單位：1.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東  廣州  510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東  廣州  510091

[摘要]
目的  探討不同間隔周期淺層X射線照射對人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白表達(dá)的影響，確認(rèn)最適輻照間隔時(shí)間。
方法  收集切除的瘢痕疙瘩組織分離培養(yǎng)原代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行不同時(shí)間間隔（1、2、3、4、5、6、7 d）淺層 X射線照射，總劑量均為15 Gy。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）與Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的相對表達(dá)，ELISA檢測細(xì)胞外上清Ⅰ型膠原蛋白改變，初步驗(yàn)證淺層 X射線治療瘢痕疙瘩的最適輻照時(shí)間間隔。對照組與不同間隔周期淺層X射線照射組Ⅰ型、Ⅲ 型膠原蛋白含量的比較采用單因素方差分析；各組間Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白mRNA下降量比值行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果  與對照組相比，不同時(shí)間間隔淺層 X射線處理后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平在間隔3 d（t=12.09，P<0.01）出現(xiàn)低峰值，Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。間隔3 d mRNA水平檢測成纖維細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白的比值下降最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.67，P<0.01）。除間隔7 d外,各實(shí)驗(yàn)組HKF細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），在間隔1 d（t=9.97，P<0.01）出現(xiàn)低峰值；而HKF細(xì)胞中Ⅲ型膠原蛋白水平與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值在間隔前3 d逐漸升高，而間隔5 d（t=0.21，P＞0.05）和間隔7 d（t=0.66，P＞0.05）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)組ELISA檢測細(xì)胞外上清Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)均下降（P<0.05）。間隔7 d照射組細(xì)胞內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及細(xì)胞外上清Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)均出現(xiàn)膠原分泌回升趨勢。
結(jié)論  照射間隔控制在3 d內(nèi)能顯著降低膠原蛋白的表達(dá)，對臨床制定放射治療方案具有重要意義。 [關(guān)鍵詞]   瘢痕疙瘩；  淺層X射線；  膠原；  成纖維細(xì)胞 瘢痕疙瘩是成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原過度累積的病理性瘢痕組織，存在與腫瘤相似的表觀遺傳學(xué)改變[1-3]。單一治療手段難以達(dá)到理想的控制效果，手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放療被證實(shí)能有效預(yù)防瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)[4]。目前臨床報(bào)道手術(shù)聯(lián)合早期淺層X射線放療對控制瘢痕疙瘩的復(fù)發(fā)更為有效[5]。據(jù)報(bào)道，瘢痕疙瘩放療在5 Gy劑量組療效較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]，且復(fù)發(fā)率與總劑量相關(guān)[7]，而關(guān)于放療的最適間隔周期尚無定論。本研究旨在探討不同間隔周期淺層X射線照射人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（human keloid fibroblasts，HKF）后，HKF及細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白表達(dá)的改變。
1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)本來源于2021年1月至2021年12月南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院行手術(shù)切除的瘢痕疙瘩標(biāo)本6例，其中穩(wěn)定期2例，進(jìn)展期4例。所有瘢痕疙瘩患者均局部無感染潰瘍，未接受過任何藥物及放射治療。經(jīng)臨床及病理確診后，所有標(biāo)本取材均已獲得患者本人或監(jiān)護(hù)人的知情同意。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo Scientific)，胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries)，Trizol和PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara），上下游引物（上海生工生物工程有限公司），SYBR Green Premix qPCR Kit（湖南艾科瑞生物工程有限公司），兔抗人Collagen Ⅰ抗體（美國CST），兔抗人Collagen Ⅲ抗體（美國Abcam），Human Collagen Ⅰ ELISA Kit（南京建成生物工程研究所有限公司），SRT-100 VisionTM淺層放射治療系統(tǒng)（美國Sensus Health）。

1.3方法1.3.1  HKF的分離培養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院手術(shù)室無菌條件下收集人瘢痕疙瘩組織用于提取和培養(yǎng)原代HKF。于超凈細(xì)胞臺用含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液多次沖洗瘢痕組織，用剪刀盡量剪去真皮下脂肪組織，將每塊組織剪至約0.1 cm×0.1 cm大小的矩形，加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵箱中，當(dāng)細(xì)胞密度長至80%時(shí)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，并進(jìn)行傳代。本實(shí)驗(yàn)中使用傳至第3代的成纖維細(xì)胞。1.3.2  不同間隔周期淺層X射線照射HKF取4×105/孔處于對數(shù)生長期的HKF接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。根據(jù)照射間隔時(shí)間不同，分別設(shè)間隔1、2、3、4、5、6、7 d 7個(gè)組，設(shè)置無照射空白對照組(0 d)，共8組。實(shí)驗(yàn)中需照射細(xì)胞均采用S-100淺層X射線放射治療系統(tǒng)，1~7組分別間隔1~7 d進(jìn)行照射，所有組單次照射劑量均為5 Gy，2-6 min，共照射3次;空白對照組不照射。1.3.3  Western blot檢測各組HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)   第22天（從實(shí)驗(yàn)組第1次照射起算），收集8組HKF，裂解破碎細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。制備好的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入稀釋的一抗，Ⅰ 型膠原蛋白（1: 1 000），Ⅲ型膠原蛋白（1:1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。顯影，拍照定影，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。1.3.4  qRT-PCR檢測各組HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)水平   利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，90 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析目的基因mRNA相對表達(dá)水平。引物由中國生工生物工程公司合成(表1)。 1.3.5  ELISA檢測各組HKF培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá) 收集HKF培養(yǎng)上清液，ELISA檢測Ⅰ型膠原蛋白的分泌水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，最后在酶標(biāo)儀中讀取各孔450 nm波長處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組HKF培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原蛋白的濃度。
1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPadPrism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果至少經(jīng)3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算得出，對照組與不同間隔周期淺層X射線照射組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2  結(jié)果2.1  不同間隔周期淺層X射線照射對HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平的影響

不同間隔周期淺層 X射線照射處理后，與未處理組（0 d）相比，各實(shí)驗(yàn)組HKF細(xì)胞中 Ⅰ 型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平均明顯降低。其中，間隔3 d組（t=12.09，P<0.01）最低（圖1）；各實(shí)驗(yàn)組HKF細(xì)胞中Ⅲ型膠原蛋白亦降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中，間隔3 d組Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)出現(xiàn)升高值，與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=5.22，P<0.05，圖1）。Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白mRNA比值與未處理組相比，間隔3 d組下降值最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.67，P<0.01），而間隔7 d Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白mRNA比值與未處理組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2  不同間隔周期淺層X射線照射對HKF中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平的影響

不同間隔周期淺層 X射線照射處理后，各實(shí)驗(yàn)組HKF細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白與未處理組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），間隔1 d組出現(xiàn)低峰值（t=9.97，P<0.01,圖2）;各實(shí)驗(yàn)組Ⅲ型膠原蛋白水平與未處理組比較，亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。與未處理組相比Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值在間隔3 d下降值最明顯（P<0.01），而間隔5 d（t=0.21，P＞0.05）和間隔7 d（t=0.66，P＞0.05）Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3  討論

瘢痕疙瘩是臨床常見的病理性瘢痕，主要組織學(xué)特征為局部成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基 質(zhì)成分過度堆積[8]。瘢痕疙瘩具有侵襲性生長、增殖和分化異常等特點(diǎn)，最關(guān)鍵的特點(diǎn)是有類似腫瘤的缺氧微環(huán)境[9]，放射療法通過直接或間接電離作用抑制細(xì)胞分裂和增殖，作為腫瘤的主要治療手段之一，同樣適用于瘢痕疙瘩[10]。目前研究表明，在不同劑量電離輻射作用下，放療后不同階段可通過激活整合素和生長因子受體增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的G2/M細(xì)胞周期停止、凋亡或其他生物學(xué)改變[11]。HKF經(jīng)電離輻射后引起DNA損傷誘導(dǎo)衰老表型，參與成纖維細(xì)胞的染色質(zhì)重塑[12]，且大量研究證據(jù)表明衰老與表觀遺傳密切相關(guān)[13]。然而，放射治療通過改變細(xì)胞周期或微環(huán)境調(diào)控表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)治療瘢痕疙瘩的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

淺層X射線聯(lián)合術(shù)后放療可以達(dá)到預(yù)防瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)的目的[14]。Sakamoto等[7]指出瘢痕疙瘩術(shù)后生物學(xué)有效劑量(BED)為20 Gy，分5次治療后復(fù)發(fā)率為11%，認(rèn)為瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)率與BED呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。Flickinger等[15]指出身體其他部位病變電子輻射劑量高于耳垂瘢痕疙瘩，且表明短療程、高分割劑量是防止復(fù)發(fā)的最佳策略。本研究采用一個(gè)特定總劑量（15 Gy）不同時(shí)間間隔（1~7 d）對HKF進(jìn)行淺層X射線照射。Ⅰ型膠原是真皮細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）主要成分，當(dāng)皮膚受傷或真皮修復(fù)期間，Ⅲ型膠原蛋白含量會暫時(shí)增加，延遲上調(diào)TGF-β3以及降低Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)[16]。本研究在不同間隔的各組經(jīng)3次連續(xù)照射后，HKF內(nèi)膠原分泌均較前減少，且間隔前3 d對細(xì)胞外上清中Ⅰ型膠原蛋白分泌水平均有顯著抑制作用（P<0.01）。而Ⅰ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值在第1~3天隨時(shí)間間隔逐漸增高，第3天達(dá)最高水平（P<0.01）。以上結(jié)果共同提示照射間隔控制在3 d內(nèi)，淺層X射線對HKF膠原蛋白的表達(dá)具有顯著影響。近期關(guān)于瘢痕疙瘩術(shù)后放射治療時(shí)機(jī)的Meta分析也總結(jié)了瘢痕疙瘩切除術(shù)后72 h內(nèi)放射治療療效優(yōu)于72 h后放射治療療效的結(jié)論[17]。X射線輻射可通過控制成纖維細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞過早衰老來防止瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)[18]。另外，細(xì)胞的無限增殖受關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)G1、G2及S期調(diào)控，間隔放射療法給予了細(xì)胞修復(fù)的時(shí)間，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換[19]。周期蛋白D/CDK4磷酸化Rb使p53激活，可抑制周期蛋白E/CDK2，使周期停止，控制細(xì)胞循環(huán)，抑制細(xì)胞增殖[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示間隔1~3 d淺層X射線照射后可能存在使細(xì)胞損傷停留在不同階段如G1/S期、G2/M期，或使處于相對抗拒放射時(shí)相的細(xì)胞向放射敏感時(shí)相移動的再分布現(xiàn)象。

瘢痕疙瘩的形成是膠原不斷沉積的結(jié)果，局部微環(huán)境除了可通過自身DNA序列改變之外，還可通過表觀遺傳學(xué)改變DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶及非編碼RNA影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路和膠原蛋白的表達(dá)[21]。一些文獻(xiàn)報(bào)道瘢痕疙瘩皮損及成纖維細(xì)胞p16基因低表達(dá)，輻射能誘導(dǎo)DNA甲基化模式發(fā)生改變和細(xì)胞周期相關(guān)基因p16、p21、p27 mRNA和蛋白水平明顯升高[22]，但具體通過特定基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)及何種途徑，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，淺層X射線可通過影響HKF膠原蛋白分泌周期抑制膠原產(chǎn)生，結(jié)合Pogribny等[23]研究發(fā)現(xiàn)不同劑量X射線輻照HKF后出現(xiàn)衰老表型特征，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平降低，推測淺層X射線治療瘢痕疙瘩療效可能歸因于對HKF表觀遺傳學(xué)影響。本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果比較淺層X射線照射后HKFⅠ型膠原蛋白/Ⅲ型膠原蛋白比值，當(dāng)兩次分割劑量時(shí)間間隔延長至4~7 d時(shí)，淺層X射線對成纖維細(xì)胞的膠原蛋白分泌作用在間隔5 d和間隔7 d出現(xiàn)回升趨勢，可能由于細(xì)胞分裂或再群體化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和膠原蛋白產(chǎn)生增加。為進(jìn)一步證實(shí)不同時(shí)間間隔淺層X射線照射后細(xì)胞外膠原蛋白表達(dá)的影響，本研究利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測培養(yǎng)基上清膠原蛋白含量，結(jié)果表明1~3 d和4~6 d膠原蛋白抑制率逐漸升高，可能存在淺層X射線照射后膠原蛋白最適抑制周期。瘢痕疙瘩除了通過COL1A1信號通路影響HKF的形成和凋亡，還受到缺氧環(huán)境等復(fù)雜微環(huán)境的影響，因此進(jìn)一步探討淺層X射線照射對細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白及表觀遺傳學(xué)改變的影響，可能是本課題未來的研究方向。

綜上所述，本研究證明了淺層X射線對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌的抑制作用，推測高張力部位需給予足夠大的輻射劑量，且照射間隔控制在3 d內(nèi)對預(yù)防瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)具有重要意義，隨著間隔時(shí)間延長，膠原蛋白分泌出現(xiàn)回升趨勢，但確切的分子機(jī)制還有待深入研究，最佳放射治療間隔周期還需結(jié)合臨床綜合評估。
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