病理性瘢痕組織中c-fos和5-HT表達(dá)及與其增生和痛癢的關(guān)系

目的 通過對病理性瘢痕組織中c-fos和5-HT表達(dá)變化的研究，探討其與病理性瘢痕痛癢和增生的關(guān)系。方法 利用免疫組化方法檢測病理性瘢痕和正常皮膚中c-fos和5-HT的表達(dá)情況。結(jié)果 痛癢的病理性瘢痕組織中c-fos、5-HT的表達(dá)顯著高于正常皮膚組織和非痛癢的瘢痕組織（ F=19.86、17.61，q=5.43～8.84， P < 0.01）;非痛癢的瘢痕組織中c-fos的表達(dá)顯著高于正常皮膚（ q=3.41，P <0.01），而5-HT表達(dá)無明顯差異（ P > 0.05 ）。結(jié)論 c-fos、5-HT表達(dá)增高可能導(dǎo)致病理性瘢痕臨床痛癢癥狀的發(fā)生，c-fos表達(dá)增高可能與病理性瘢痕的形成、發(fā)展有關(guān)。 　瘙癢和灼痛是病理性瘢痕常見的臨床癥狀，尤其在瘢痕增生的早期，往往痛癢越重者，瘢痕增生越快，但是痛癢的發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜，涉及到神經(jīng)生理、內(nèi)源性生化物質(zhì)等多個(gè)方面。許多體內(nèi)外的因素及細(xì)胞受損后所產(chǎn)生的物質(zhì)均能引起痛癢，其機(jī)制目前尚不十分清楚。本研究采用免疫組化方法檢測原癌基因c-fos和5-羥色胺（5-HT）在痛癢、非痛癢瘢痕及正常皮膚組織中的表達(dá)情況，旨在探討這兩種生化遞質(zhì)的變化與病理性瘢痕增生及其痛癢癥狀相關(guān)性，為臨床治療瘢痕增生及痛癢癥狀提供新思路。 1 材料和方法 　　1.1 標(biāo)本的取材與分組 瘢痕標(biāo)本均來源于我院整形外科門診手術(shù)病人（病程6～24個(gè)月）典型的病理性瘢痕（瘢痕疙瘩或 增生性瘢痕）組織，標(biāo)本取瘢痕中心部分0.7 cm×1.0 cm全層組織塊;正常皮膚取自美容手術(shù)病人，修剪至0.5 cm×0.7 cm大小。A組（痛癢瘢痕組）:瘢痕潮紅，高出皮面，觸之硬，具有明顯的瘙癢或刺痛癥狀;B組（無痛癢瘢痕組）:無任何自覺癥狀;C組（正常皮膚組）:取自無瘢痕體質(zhì)及免疫性疾病的外科手術(shù)病人，每組標(biāo)本20例。 　　1.2 免疫組化檢測及結(jié)果判定 采用通用型二步法，兔抗人5-HT多抗（工作液）為美國Zymed公司產(chǎn)品，兔抗人c-fos多抗（稀釋度1∶100）為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，Pic-TureTM-PV6000免疫組化染色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。其中，檢測c-fos行微波抗原修復(fù)。DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間。陰性對照省略一抗，以PBS代替。染色陽性信號為細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。 　　1.3 圖像定量分析采用 VIDAS 圖像分析系統(tǒng)（德國 Opton 公 司），設(shè)定灰度級為256級，白為0，黑為255;每組切片隨機(jī)選取5張，光鏡下（40倍）每張切片按系統(tǒng)抽樣法隨機(jī)取10個(gè)視野;對所測定組織的背底進(jìn)行面積、灰度、吸光度測定，制定標(biāo)準(zhǔn)作為參考值;通過計(jì)算機(jī)自動數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)計(jì)算出所測細(xì)胞平均吸光度、面密度、積分吸光度，以積分吸光度為主要指標(biāo)進(jìn)行定量分析。 　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 圖像分析數(shù)據(jù)以 x±s 表示，應(yīng)用SPSS 10.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。 　　2 結(jié)果 　　2.1 形態(tài)學(xué)觀察 　　2.1.1c-fos免疫組化染色 在正常皮膚組織中，c-fos蛋白產(chǎn)物主要分布于表皮基底層細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮脂腺及毛囊上皮細(xì)胞，胞核及胞質(zhì)均有著色。在痛癢的瘢痕組織中，除表皮基底層細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞染色陽性外，在膠原結(jié)節(jié)、漩渦狀結(jié)構(gòu) 中的成纖維細(xì)胞中呈陽性著色，密度高、著色濃。在無痛癢的瘢痕組織中，c-fos蛋白分布于表皮基底層細(xì)胞，但分布密度及著色較痛癢的瘢痕組織淡而稀少，成纖維細(xì)胞中c-fos蛋白陽性分布很少。 　　2.1.25-HT免疫組化染色 5-HT表達(dá)陽性細(xì)胞主要是表皮基底層細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚附屬器、成纖維細(xì)胞，痛癢的瘢痕組織5-HT蛋白陽性著色程度及陽性細(xì)胞分布范圍強(qiáng)于、大于非痛癢的瘢痕組織及正常皮膚組織。 　　2.2 圖像定量分析結(jié)果 　　2.2.1c-fos c-fos陽性分布的平均吸光度、面密度和積分吸光度均以A組最高，C組最低。其中A組和B組c-fos的表達(dá)均顯著高于C組（ F=19.86，q=3.41、8.84，P <0.01）;A組又顯著高于B組（ q= 5.43，P <0.01）。見表1。 　　2.2.25-HT A組5-HT的表達(dá)均顯著高于B組和C組（ F=17.61，q=7.86、6.47，P <0.01）;B組和C組相比差異無顯著性（ P >0.05）。見表1。 　　表1 正常皮膚及瘢痕組織中c-fos和5-HT圖像分析結(jié)果（略） 　　3 討論 　　增生性瘢痕與瘢痕疙瘩是臨床上常見的病理性瘢痕，是創(chuàng)傷愈合反應(yīng)過度的結(jié)果，表現(xiàn)為瘤樣增生并伴有不同程度的痛癢癥狀，通常痛癢癥狀越重者，瘢痕增生越快。目前多數(shù)學(xué)者致力于瘢痕發(fā)病機(jī)制的研究，而有關(guān)病理性瘢痕的痛癢機(jī)制研究尚不多見。已有研究證實(shí)，瘢痕疙瘩及增生性瘢痕中神經(jīng)纖維增生、粗大、排列雜亂，其組織中肥大細(xì)胞數(shù)量增多，提示神經(jīng)及生化遞質(zhì)的變化與痛癢癥狀有關(guān)，但有關(guān)神經(jīng)纖維及神經(jīng)遞質(zhì)、生化遞質(zhì)的變化與病理性瘢痕痛癢相關(guān)性的研究目前在國內(nèi)外尚罕見報(bào)道。為此，本研究檢測了c-fos和5-HT在病理性瘢痕中的表達(dá)情況，旨在探討這兩種生化遞質(zhì)的變化與病理性瘢痕增生及其痛癢癥狀的相關(guān)性。 　　3.1 c-fos 即刻早期基因c-fos是編碼核蛋白的癌基因，其產(chǎn)物具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，介導(dǎo)細(xì)胞由靜止期向增殖期轉(zhuǎn)化并在傷口愈合中起作用。它在大多數(shù)正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低，但可受多種炎癥遞質(zhì)、炎癥細(xì)胞 和細(xì)胞因子刺激激活，激活后可激活多種炎癥遞質(zhì)及細(xì)胞因子［1］。原癌基因c-fos的表達(dá)與細(xì)胞生長、分化和啟動細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)［2］。本研究顯示，瘢痕組織中c-fos免疫陽性細(xì)胞分布密度顯著高于正常皮膚組織。c-fos蛋白產(chǎn)物主要分布于基底層細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及增生性瘢痕組織的成纖維細(xì)胞中，這些細(xì)胞均是功能活躍的細(xì)胞。基底層細(xì)胞是皮膚組織中有絲分裂和新陳代謝最為活躍的細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞可合成內(nèi)皮素等許多細(xì)胞因子，成纖維細(xì)胞是皮膚組織中膠原合成的主要來源，據(jù)此推測c-fos的表達(dá)可能與這些細(xì)胞的功能有關(guān)。成纖維細(xì)胞是皮膚傷口愈合和瘢痕增生的關(guān)鍵細(xì)胞，與膠原和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生密切相關(guān)，c-fos在瘢痕組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，提示它們的表達(dá)可能在瘢痕增生中起重要作用。有研究表明，瘢痕組織中高水平的TGF-β可不斷刺激c-fos的表達(dá)，并促進(jìn)膠原合成，致使瘢痕增生［3］。本文結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，即病理性瘢痕組織中c-fos的表達(dá)高于正常皮膚組織，提示c-fos的激活可能參與了成纖維細(xì)胞的分化增殖或表型轉(zhuǎn)化或膠原合成與降解，以及對細(xì)胞因子的調(diào)控并導(dǎo)致瘢痕異常增生。 　　近年來研究結(jié)果表明，c-fos還與疼痛關(guān)系密切。c-fos基礎(chǔ)表達(dá)水平很低，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)與痛覺調(diào)制有關(guān)，外周傷害性刺激可使脊髓背角c-fos蛋白表達(dá)增加，c-fos蛋白可作為傷害性感受神經(jīng)元被激活的標(biāo)志物［4］。HUNT等［5］首次證明c-fos與疼痛的關(guān)系，即外周的傷害性刺激可以快速誘導(dǎo)c-fos的表達(dá)。張仲文等［6］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，硬膜外瘢痕粘連和疼痛程度與c-fos表達(dá)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)，c-fos蛋白在痛癢的病理性瘢痕組織中表達(dá)顯著高于非痛癢的病理性瘢痕組織，正常皮膚組織僅有少量表達(dá)，提示c-fos的激活與病理性瘢痕臨床痛癢癥狀的發(fā)生密切相關(guān)。目前對這方面的研究尚未見報(bào)道，根據(jù)原癌基因的生物學(xué)，并結(jié)合有關(guān)體外試驗(yàn)，作者推測:原癌基因c-fos影響瘢痕痛癢可能是通過作用于不同類型細(xì)胞（包括組織修復(fù)細(xì)胞與炎性細(xì)胞）和調(diào)控生長因子的產(chǎn)生兩條途徑來實(shí)現(xiàn)的，即原癌基因持續(xù)高表達(dá)將激活成纖維細(xì)胞生長因子基因或成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致組織修復(fù)過度，激活炎癥細(xì)胞又將導(dǎo)致蛋白酶分泌增多而使胞外基質(zhì)溶解增加，從而釋放多種可致痛癢的遞質(zhì)，但其具體作用機(jī)制以及c-fos具體高到什么程度才能引起疼痛，還有待于進(jìn)一步研究。 　　3.25-HT 作為一種經(jīng)典的致痛致癢遞質(zhì)，5-HT在體內(nèi)廣泛分布并具有多種生物活性，它不僅是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，也是重要的免疫調(diào)節(jié)因子。它在周圍組織中的致痛機(jī)制是:當(dāng)組織破壞時(shí)，5-HT從解體的血小板中釋放出來，低濃度即可致痛，且主要參與血管性疼痛、損傷性疼痛。1985年NARA［7］采用Nin-hydin法分別測定了人正常皮膚和瘢痕組織中5-HT的含量，發(fā)現(xiàn)5-HT可致創(chuàng)傷愈合后非穩(wěn)定瘢痕組織的痛癢感，并且發(fā)現(xiàn)瘢痕組織中5-HT的多寡與傷后時(shí)間長短無關(guān)，但與傷后瘢痕狀態(tài)有關(guān)，肥厚、發(fā)紅并攣縮的非穩(wěn)定型瘢痕組織5-HT含量明顯高于傷后早期穩(wěn)定型瘢痕組織。但他并未將痛癢和非痛癢的瘢痕明確分組。本研究顯示，痛癢的瘢痕組織中5-HT蛋白陽性著色程度及陽性細(xì)胞分布范圍強(qiáng)于非痛癢的瘢痕組織及正常皮膚組織;非痛癢的瘢痕組織和正常皮膚組織相比無顯著差異，提示5-HT表達(dá)的升高可導(dǎo)致病理性瘢痕疼痛、瘙癢癥狀的發(fā)生。而NARA在正常人皮膚中未檢測到5-HT，可能與不同實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)，他所采用的Nin- hydin法不足以測定出正常人皮膚中微量的5-HT。有關(guān)結(jié)締組織代謝與5-HT關(guān)系的報(bào)道較少，但存在著兩方面的意見。NAGAI［8］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)締組織中5-HT含量比組胺少得多，認(rèn)為5-HT在結(jié)締組織中的作用是次要的。崔玉芳等［9］則認(rèn)為5-HT對離體培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞也有促增殖作用，且這種作用有時(shí)甚至比組胺還強(qiáng)。通過以上的研究推測:c-fos、5-HT可能與病理性瘢痕的臨床痛癢癥狀有關(guān)，這兩種生化遞質(zhì)的表達(dá)增高可能導(dǎo)致痛癢癥狀的發(fā)生，c-fos還可能促進(jìn)病理性瘢痕的增生。據(jù)此，設(shè)想若能通過調(diào)控瘢痕組織中c-fos、5-HT的含量來抑制瘢痕的生長和減輕瘢痕的痛癢癥狀，將為病理性瘢痕防治提供一種新途徑［10］，但其確切的反應(yīng)途徑和方式還有待于進(jìn)一步研究。

疤痕修復(fù)

缺少的東西終于再慢慢補(bǔ)上了.