中國(guó)人群瘢痕疙瘩家系易感基因的定位研究

　【摘要】 目的： 定位中國(guó)人群瘢痕疙瘩家系的易感基因. 方法： 選擇2個(gè)中國(guó)人群瘢痕疙瘩大家系，從中選出51名成員，采集其外周靜脈血樣，提取基因組DNA；參照國(guó)外最近相似研究的文獻(xiàn)報(bào)道，采集其外周靜脈血樣，提取基因組DNA；參照國(guó)外最近相似研究的文獻(xiàn)報(bào)道，在染色體2q23上選取6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物片斷基因分型，再進(jìn)行連鎖分析. 結(jié)果： 在重組率θ=0時(shí)，這些微衛(wèi)星標(biāo)記的兩點(diǎn)LOD值絕大部分＜-2，排除連鎖關(guān)系存在. 結(jié)論： 中國(guó)人群瘢痕疙瘩家系的易感基因位點(diǎn)不在染色體2q23上. 　　【關(guān)鍵詞】 瘢痕疙瘩家系；連鎖分析；微衛(wèi)星標(biāo)記；易感基因；異質(zhì)性 　　【中圖號(hào)】 R596.2 　　0引言 　　瘢痕疙瘩(keloid)是人體皮膚損傷后的一種病理性瘢痕愈合，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚. 流行病學(xué)調(diào)查表明，瘢痕疙瘩大多散發(fā)發(fā)病，但具有一定的家族遺傳傾向，且存在顯著的種族差異性［1-2］. Cosman等［3］證明其家族性發(fā)病率約為3％，深膚色人種好發(fā). 國(guó)內(nèi)外的研究一致認(rèn)為，瘢痕疙瘩的遺傳模式為常染色體顯性遺傳,伴外顯不完全，其臨床表型存在個(gè)體差異［4-5］. 最近，Marneros等［6］的研究首次發(fā)現(xiàn)了1個(gè)日本家系和1個(gè)非洲裔美國(guó)人家系瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)分別與染色體2q23和7p11連鎖的遺傳學(xué)證據(jù)，對(duì)進(jìn)一步尋找瘢痕疙瘩發(fā)病的相關(guān)基因具有指導(dǎo)意義. 但是，有關(guān)中國(guó)人群瘢痕疙瘩易感基因的定位至今仍未見(jiàn)報(bào)道，由于中國(guó)漢族人種與日本人種同屬蒙古人種，而非洲裔美國(guó)人屬尼格羅人種，為此，我們收集了來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)的1個(gè)5代發(fā)病和1個(gè)4代發(fā)病的中國(guó)漢族人群瘢痕疙瘩大家系，從中分別選取32位和19位具有較高遺傳病研究意義的成員作為研究對(duì)象，在上述研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，在染色體2q23及其周圍選擇已知的兩點(diǎn)LOD值＞1的6個(gè)微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記，通過(guò)連鎖分析以驗(yàn)證中國(guó)人群瘢痕疙瘩家系易感基因位點(diǎn)是否也在染色體2q23上. 　　1對(duì)象和方法 　　1.1對(duì)象1個(gè)5代發(fā)病的NM（內(nèi)蒙）家系和1個(gè)4代發(fā)病的LN（遼寧）家系（圖1，2）. 遵照赫爾辛基宣言的準(zhǔn)則采集血樣和病理組織標(biāo)本. 指定2名對(duì)瘢痕疙瘩診斷和治療有相當(dāng)臨床經(jīng)驗(yàn)的整形外科醫(yī)師，根據(jù)瘢痕疙瘩診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］（即瘢痕超過(guò)原有損傷范圍并向周圍正常皮膚侵犯，或瘢痕病程超過(guò)1年仍無(wú)自發(fā)消退征象，或術(shù)后瘢痕復(fù)發(fā)者）對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行全面的體格檢查、詳細(xì)的病史詢問(wèn)和準(zhǔn)確的臨床診斷，并對(duì)部分患者的瘢痕疙瘩組織取活檢行組織病理學(xué)檢查以確診. 我們從NM和LN家系中分別選出32位和19位成員作為研究對(duì)象（即系譜圖中標(biāo)號(hào)者），采集他們的外周靜脈血樣. 　　圖1瘢痕疙瘩家系系譜（略） 　　圖2LN瘢痕疙瘩家系系譜（略） 　　1.2方法抽取這51名家系成員的外周靜脈血各2 mL(EDTA抗凝)，經(jīng)SDS裂解，蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀基因組DNA后，用ddH2O溶解，放置-20℃保存以備后用. 根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］在染色體2q23及其周圍共約33.4 Mbp區(qū)域內(nèi)選取已知的6個(gè)兩點(diǎn)LOD值＞1的微衛(wèi)星標(biāo)記D2S1328（LODZMAX=2.01）， D2S349 （LODZMAX=2.84）， D2S1399 （LODZMAX=2.86）， D2S356（LODZMAX=2.84）， D2S2275 （LODZMAX=2.29）和D2S1353 （LODZMAX=0.89），通過(guò)UCSC Genenome(http://genome.ucsc.edu)和Ensembl（http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/markerview）遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，查找出這些微衛(wèi)星標(biāo)記的上下游引物序列(表1)，再合成相應(yīng)的引物. 根據(jù)上述各自的上、下游引物序列設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的PCR引物，PCR擴(kuò)增在PE9700型PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行. PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 50～100 ng，上、下游引物各10 μmol/L（1 μL），GeneAmp dNTP 1 μL，Takaka Ex Taq DNA聚合酶33.34 nkat，10×Ex Tag Buffer（Mg2+ Plus） 1 μL，加雙蒸去離子水至總體積10 μL. PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min后,94℃變性30 s，55℃～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，38次循環(huán)后,72℃延伸10 min. 熒光標(biāo)記引物由上海基康生物技術(shù)有限公司提供，PCR擴(kuò)增試劑由Applied Biosystems公司提供. 將Hi?Di Formamide 1 mL和GeneScan?500 LIZ Size Standard 50 μL混合后，取9.5 μL同PCR產(chǎn)物（20倍稀釋后） 0.5 μL混合，95℃變性5 min后迅速冰浴冷卻5 min，再在ABI PrismTM 310 Genetic Analyzer上用PE公司的POP?4膠，15 kV，60℃下，電泳28 min. 電泳數(shù)據(jù)經(jīng)Genescan軟件（V3.11）, Genotyper（V.3.7）處理后得到檢測(cè)片段大小和基因型. 以上儀器、試劑及軟件由美國(guó)Perkin Elmer公司提供. 基因分型數(shù)據(jù)經(jīng)家系和人工校對(duì)后，用連鎖分析軟件Linkage（V.5.11）的Mlink程序計(jì)算每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的兩點(diǎn)LOD（log of the odds，Lod）值，其中重組率θ=0～0.4；遺傳模式為常染色體顯性遺傳伴不完全顯性，外顯率90%，擬表型1％，群體疾病基因型頻率1/1000 ［5-6］；根據(jù)算出的兩點(diǎn)LOD值判斷連鎖關(guān)系. LOD值表示在不同重組率（θ）的條件下，兩位點(diǎn)連鎖的可能性與不連鎖的可能性之間概率比值的對(duì)數(shù). LOD值?1支持連鎖，LOD值?3肯定連鎖，LOD值?-2否定連鎖. 　　表1微衛(wèi)星標(biāo)記名稱、位置、引物序列及產(chǎn)物大?。裕? 　　2結(jié)果 　　連鎖分析結(jié)果表明，在重組率θ=0時(shí)，兩點(diǎn)LOD值除NM家系中D2S1399的為0.71和LN家系D2S349的為-0.12外，其余微衛(wèi)星標(biāo)記的均＜-2（表2，3）. 　　3討論 　　我們所選擇的瘢痕疙瘩家系中共有3個(gè)肯定攜帶者，可以解釋為外顯不完全，也可以認(rèn)為是不規(guī)則顯性遺傳，即雜合子的顯性由于某種原因而不表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀，但他們卻可以生出具有該性狀的后代，因此在系譜中可以出現(xiàn)隔代遺傳現(xiàn)象，目前認(rèn)為機(jī)體的內(nèi)外環(huán)境對(duì)基因表達(dá)所產(chǎn)生的影響和不同個(gè)體所具有的不同遺傳背景可能是引起不規(guī)則顯性的重要因素［8］；而LN家系性狀遺傳表現(xiàn)為完全外顯，遵循典型的常染色體顯性遺傳規(guī)律. 家系中出現(xiàn)雙親未發(fā)病而子女發(fā)病的現(xiàn)象，提示相關(guān)基因可能出現(xiàn)了新的變異. 經(jīng)文獻(xiàn)檢索，本研究所選擇的這2個(gè)家系是至今所報(bào)道的中國(guó)人群瘢痕疙瘩家系中最大和最多的，其中NM家系5代63人，健在成員4代56人，發(fā)病5代14人，健在患者3代11人；LN家系4代49人，健在成員4代48人，發(fā)病4代10人，健在患者3代9人. 它們都能較好地滿足遺傳病研究對(duì)家系的要求，對(duì)中國(guó)人群瘢痕疙瘩致病基因等相關(guān)研究具有較好的代表性. Marneros等［6］發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩日本家系與染色體2q23連鎖，并認(rèn)為位于染色體2q23的153cM(152 Mbp)處的壞死因子?α抑制蛋白6（TNFAIP6）基因是瘢痕疙瘩的一個(gè)候選基因，但是對(duì)這個(gè)候選基因的外顯子、內(nèi)含子與外顯子的拼接點(diǎn)及啟動(dòng)子序列進(jìn)行測(cè)序，并未發(fā)現(xiàn)突變存在. 因此，認(rèn)為在該候選基因位點(diǎn)附近可能存在其它基因突變，才導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成. 另外，他們還報(bào)道了對(duì)一個(gè)有10人發(fā)病的非洲裔美國(guó)人中等大小的瘢痕疙瘩家系進(jìn)行同樣的研究，卻沒(méi)發(fā)現(xiàn)與2q23和7p11存在連鎖關(guān)系，說(shuō)明瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)存在異質(zhì)性. Marneros等［6］的研究首次發(fā)現(xiàn)了存在瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)的遺傳學(xué)證據(jù)，對(duì)進(jìn)一步尋找瘢痕疙瘩的致病基因具有重要的指導(dǎo)意義. 　　由于瘢痕疙瘩的發(fā)病存在顯著的種族差異性，為了驗(yàn)證中國(guó)人群瘢痕疙瘩家系易感基因位點(diǎn)是否也分布在上述染色體區(qū)域，為此，我們選取了這2個(gè)中國(guó)人群瘢痕疙瘩大家系，以同樣的方法進(jìn)行研究，其連鎖分析結(jié)果顯示可以排除該瘢痕疙瘩家系與2q23的連鎖關(guān)系，再次證明了瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)存在異質(zhì)性，提示瘢痕疙瘩易感基因可能存在種族特異性，即不同種族瘢痕疙瘩的形成可能由不同的致病基因調(diào)控，這與流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩好發(fā)于有色人種尤其多發(fā)于深膚色人種的現(xiàn)象相一致. 最近，張剛等［9］采用比較基因組雜交方法檢測(cè)了6例瘢痕疙瘩患者的染色體后發(fā)現(xiàn)染色體1p,16p,20q和22p存在部分缺失，推測(cè)這種缺失導(dǎo)致抑制性基因的丟失，造成瘢痕疙瘩的發(fā)生和發(fā)展，從而認(rèn)為瘢痕疙瘩的發(fā)病可能與染色體的結(jié)構(gòu)畸變有關(guān). 由此可見(jiàn)，瘢痕疙瘩是一種復(fù)雜的遺傳性疾病，要準(zhǔn)確定位和明確瘢痕疙瘩的致病基因，需要收集數(shù)量更多質(zhì)量更高種族來(lái)源更廣的家系，并應(yīng)用更先進(jìn)的研究方法，如全基因組掃描、選擇多態(tài)性更高的SNP作為遺傳標(biāo)記和對(duì)候選基因進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)基因突變等.

疤痕修復(fù)

都是從哪里找來(lái)的?辛苦了!

布布

太復(fù)雜了,怎么著跟遺傳也會(huì)有點(diǎn)關(guān)系的....有些詞太專業(yè)看不太懂.

hgy

我的幾個(gè)親戚也有疤痕疙瘩,我想大概是有遺傳基因